<855> 散射光浊度法和透射光比浊法

1.     介绍

散射光浊度法和透射光比浊法是基于光散射现象原理的分析技术。光散射是一种物理现象，其中光束由于与足够小的物质粒子相互作用而改变其传播方向（称为偏转）。根据麦克斯韦电磁理论，散射发生的先决条件是悬浮颗粒的折射率必须不同于悬浮液体的折射率。差异越大，散射越强烈。光散射有两种类型：1）弹性散射，其中散射光和入射光的波长相同；2）非弹性光散射，其中散射光和入射光的波长不同。只有第一种光散射（弹性）与散射光浊度法和透射光比浊法有关。

在透射光比浊法中，测量透射光的强度，并在入射光方向（即0°）测量散射导致的入射光强度的衰减，并与入射光强度进行比较（空白测量）。被测特性是悬浮颗粒散射效应的间接测量，称为浊度。悬浮样品对光的任何吸收都会导致光强度的额外衰减（参见<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy和<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice）。因此，确保被测材料不会吸收测量波长处的光非常重要。实际上，控制吸收和浊度测定的方程式是相同的（尽管衰减常数的值不同）。在散射光浊度法中，测量与入射光传播方向成90°角的散射光强度。因此，散射光浊度法浊度测量是对悬浮物散射效应的直接测量。

2. 术语和定义

描述浊度法和浊度法的常用术语包括：

•浊度（符号S）：由于悬浮颗粒的光散射效应，透射入射光束强度降低的一种度量。悬浮物的量可以通过观察透射光（比浊法）或散射光（浊度法）来测量。

log I₀/I_t = kbc = T

I₀=入射光强度

I_t=透射光强度

k=摩尔浊度系数

b=样品池路径长度

c=浓度

T=浊度

•浊度（符号，τ）：在透射光浊度测量中，浊度是给定悬浮液的入射光束强度/单位长度减少的量度。国际标准化组织将浊度定义为“由于存在未溶解物质而导致液体透明度降低"。

•浊度测量单位：浑浊度单位用一个描述符表示，该描述符指示测量方法。

•散射光浊度计浊度单位（NTU）：当使用散射光浊度法测量浊度时，浊度计以与入射光传播方向成90°角的角度测量散射光，浊度单位称为散射光浊度法浊度单位（NTU）。NTU的大小是根据初级福尔马肼标准品（一种将硫酸肼和六亚甲基四胺溶液混合在水中制成的悬浮液）产生的浊度定义的。更安全的聚合物微珠悬浮液现已上市，并被*为可接受的替代品。然而，所有这些标准都可以追溯到福尔马肼。初级福尔马肼标准溶液的浊度为4000 NTU。

其他*的浊度单位包括福尔马肼比浊法单位（FTU）和福尔马肼浊度法单位（FNU）。这些单位相当于0-40 NTU范围内的NTU。

3.     应用

透射光比浊法和散射光浊度法技术的应用包括1）溶液和/或悬浮液的浓度测定（通过在控制良好的反应参数下沉淀和悬浮产生的沉淀物，来测定几种阳离子和阴离子）；2）测量混浊溶液或悬浮液的浊度；3）测定分子量在1000到数亿之间的多分散体系的重均分子量和尺寸；4）测量免疫分析的反应动力学或免疫沉淀动力学（比率散射浊度法）；5）监测细胞和细菌的生长；6）悬浮物粒度分布测定、颗粒计数等。

比率散射浊度法广泛用于疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它还用于重组生物制药中的宿主细胞蛋白质鉴定。当使用该技术时，通过测量抗原-抗血清或抗原纯化抗体复合物的光散射反应的变化，来计算导致免疫抗体-抗原沉淀反应或凝集反应的抗原（Ag）或抗体（Ab）的量。通常考虑抗原共价连接或吸附在聚合物微球上，以提高散射效率；由此产生的技术被称为“颗粒增强免疫分析"。虽然这项技术被称为散射光浊度法，但通常散射光和透射光都是用比率仪器测量的。

散射光法浊度测量在低浊度范围（散射介质浓度相对较低）更可靠。在该范围内，观察到样品浓度与检测器信号强度（以NTU表示）之间存在线性关系。随着浓度的增加，多次散射的入射角也会增加，从而偏离线性响应。支持可靠线性关系的最大NTU值在1750–2000 NTU范围内。透射光比浊法适用于更高的浊度范围（散射介质的浓度）。为了获得一致的结果，必须仔细控制所有测量变量。在可能的情况下，可以测量极稀的悬浮液。

4. 仪器仪表

用于透射光比浊法和散射光浊度法测量的仪器分别称为透射光浊度计和散射光浊度计。通常，这些仪器包括一个带有滤光器的汞灯（用于强绿线或蓝线）、一个快门、一组具有已知透射率的中性滤光器和一个灵敏的光电倍增管，该光电倍增管可安装在与入射光传播方向成0°或90°角的位置，或者在一个臂上，它可以围绕溶液单元旋转，并通过不透光外壳外的表盘设置为−135°到0°到+135°的任何角度。溶液池的形状多种多样，例如用于测量90°散射的正方形；45°、90°和135°散射为半八角形；圆柱形可适用于所有角度的散射（见图1）。

图1.代表性浊度仪。注意，探测器2可安装在可移动臂上。

浊度也可以用标准光电滤光光度计或分光光度计测量，最好是在光谱的蓝色部分进行照明。散射光浊度法测量需要一个装有光电管的仪器，以便接收散射光，而不是透射光。由于这与荧光计中使用的几何结构相同，因此可通过适当选择滤光片将其用作浊度计。比率浊度计结合了90°散射光浊度法和透射光比浊法。它包含光电管，接收和测量与样品成90°角的散射光，以及接收和测量样品前面的前向散射光。它还测量直接穿过样品的光。通过90°角散射光测量值，前向散射光测量值和透射光测量值之和，计算两者的比值，可获得线性度。使用比率浊度测量系统的好处是杂散光的测量变得可以忽略不计。此外，彩色悬浮液的浊度测定仅使用透射光比浊法浊度仪或浊度仪（带比率模式）进行，因为该程序补偿了悬浮液颜色导致的光衰减。通常，这些仪器中的光源是钨灯，在2700 K的灯丝温度下工作，大部分光强约为550 nm。也可使用其他合适的光源。通常，探测器是▲硅二极管▲和光电倍增管。另一种消除颜色效应的方法是使用红外发光二极管作为光源，其最大发射中心约为860 nm，光谱带宽为60 nm。当激光光源也被使用时，尤其是在浊度测量仪器中，这种技术通常被称为“激光浊度测量"。使用激光散射光浊度计的优点是，在非常低的检测水平下，信噪比显著提高。通常光源是工作波长为660 nm的激光二极管。激光束的高功率密度使较小粒子产生更高的散射强度。与吸收未散射光的光阱相结合，该系统可显著降低杂散光。当专著中的某个程序指示使用散射光浊度计或透射光浊度计时，可以使用在比率模式下工作的仪器。

5. 福尔马肼浊度标准

福尔马肼是目前已知的主要浊度标准。所有其他标准都是次要的，必须追溯到福尔马肼。 主要标准在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲（ERR 1-May-2019）第 2 版（金书）中被定义为由用户使用明确定义的方法和条件从可追溯的材料准备的标准。

福尔马肼悬浮液有许多特点，以确保其适合作为主要标准。它可以从试剂级的起始材料中始终如一、准确地制备。该悬浮液由不同长度和随机构型的聚合物组成，其组成的聚合物的形状和尺寸从小于0.1 μm到大于10 μm不等。尽管聚合物链长分布已被证明因制备而异，但总的浊度结果是可以很好地重现的。

5.1 Preparation of the Formazin Standards 福尔马肼标准液的制备

•硫酸肼溶液：将1.000 g ACS级硫酸肼（N₂H₄·H₂SO₄）溶解在100 mL 的A类容量瓶中中，并用无颗粒水稀释至刻度。让该溶液静置4-6小时。

•初级福尔马肼标准液：将2.50 g分析级六亚甲基四胺[(CH₂)₆N₄]溶于25.0 mL无颗粒水中，装入100 mL烧瓶。使用A类25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液，并充分混合。使用前，让制剂在25±1°的温度下静置48小时。由此产生的悬浮液可稳定运行2个月。

•福尔马肼储备标准悬浮液1：使用15 mL A类移液管，将15 mL福尔马肼初级标准液转移至1 L容量瓶中，并用无颗粒水稀释至刻度并混合。所得悬浮液的浊度为60 NTU。

•福尔马肼储备标准悬浮液2：使用50 mL A类移液管，将50 mL福尔马肼初级标准液转移至200 mL容量瓶中，并用无颗粒水稀释至刻度并混合。所得悬浮液的浊度为1000 NTU。

•福尔马肼参考悬浮液：根据表1，在100 mL容量瓶中混合各份福尔马肼储备标准悬浮液和无颗粒水，制备福尔马肼参考悬浮液。